همسانه سازی و بیان ایمونوتوکسین اونتاک به صورت هیبریدی با دنباله اینتئینی

اینتئین ها بخش های درونی در برخی پروتئین های مخمری و یوکاریوت های تک سلولی هستند که می توانند در فرآیند پیرایش پروتئین ها از مابقی پروتئین جدا شوند. بعد از شناسایی مکانیسم عملکرد اینتئین ها، کاربرد این توالی ها در تخلیص تک مرحله ای پروتئین های نوترکیب مورد توجه قرار گرفته و دنباله های خود برشگر اینتئینی مختلفی گسترش یافتند. مزیت روش کاربرد دنباله های اینتئینی برای تخلیص پروتئین ها نسبت به بقیه روش های تخلیص پروتئین، عدم احتیاج به آنزیم های پروتئازی و مراحل حذف پروتئاز می باشد که این روش را از لحاظ اقتصادی حائز اهمیت می کند. در این مطالعه، ژن به رمز درآورنده Denileukin Diftitox (با نام تجاری اونتاک،Ontak) بصورت مولکولی با دنباله اینتئینی تلفیق گردید و میزان بیان آن در پلاسمید pTXB1 مورد بررسی قرار گرفت.
در این مطالعه، بر اساس جایگاه های چندتایی همسانه سازی(MCS) وکتور pTXB1، پرایمرهای مناسب طراحی شدند و پس از تکثیر قطعه کدکننده اونتاک، همسانه سازی با استفاده از آنزیم های NdeI و SapI انجام گرفت. این سازه نوترکیب(PTX-IDZ) به سلول های E.coli سویه ER2566 ترانسفورم گردید و بیان اونتاک مورد مطالعه قرار گرفت.
همسانه سازی توالی اونتاک در تلفیق با دنباله اینتئینی در وکتور بیانی pTXB1 توسط PCR و برش آنزیمی تائید شد. بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE آنالیزو با روش لکه گذاری وسترن تائید گردید.
جایگاه آنزیم محدودکننده SapI در محل تلفیق توالی اونتاک با دنباله اینتئینی عدم ورود هیچ اسید آمینه اضافه ای را در پروتئین هدف، تضمین می نماید. همچنین بیان ایمونوتوکسین اونتاک در این سازه نسبت به بیان این پروتئین به صورت تلفیق شده با دنباله هیستیدینی ارزیابی گردید. با توجه به بیان مناسب پروتیئن اونتاک، در مراحل بعدی، تخلیص تک مرحله ای پروتئین دارویی اونتاک انجام خواهد گرفت.