خالص سازی آلفا توکسین سویه بومی NH2 کلستریدیوم سپتیکوم و تولید آنتی بادی آن

کلستریدیوم سپتیکوم عامل ایجاد بیماری های حاد متعددی در انسان و حیوانات است. آلفاتوکسین مهمترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم سپتیکوم است و فعالیتهای همولیتیکی، نکروتیکی و کشندگی دارد.

درمطالعه حاضر، خالص سازی آلفاتوکسین سویه بومی کلستریدیوم سپتیکوم NH2 و تهیه آنتی بادی علیه آن انجام شده که می تواند در تهیه کیت های تشخیصی ، آزمون توانایی واکسن و موارد مرتبط مورد استفاده قرار گیرد.

سویه بومی کلستریدیوم سپتیکوم NH2 در محیط جگر کشت داده شد. آلفاتوکسین مترشحه در محیط کشت، طی سه مرحله خالص سازی شد: رسوب دادن با آمونیوم سولفات 25 و 60 % اشباع، کروماتوگرافی تغییر یونی با ستون DEAE-Sephadex و ژل فیلتراسیون بر روی SephadexG-50. در تمامی مراحل میزان آلفا توکسین مورد اندازه گیری قرار گرفت و روش خالص سازی با SDS-PAGE ارزیابی شد. متعاقب ایمن سازی خرگوش با آلفاتوکسین و تهیه سرم از حیوان، ایمونوگلوبین با یک فرایند سه مرحله ای خالص شد: آمونیوم سولفات، کروماتوگرافی تغییر یونی و ژل فیلتراسیون. عملیات مسیر خالص سازی آنتی بادی به وسیله آزمون های الکتروفورز، ایمونودیفیوژن دوطرفه و شعاعی یکطرفه(SRID) ، وسترن بلات و SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت.

مراحل خالص سازی که با آمونیوم سولفات 25% آغاز و با 60% ادامه یافت موجب حذف بسیاری از پروتئین ها گردید. نتایج کروماتوگرافی تعویض یونی با غلظت های مختلف نمک نشان داد که غلظت 0.4 مولار نمک می تواند از همه بیشتر آلفاتوکسین را از ستون DEAE جدا نماید. آلفاتوکسین در مرحله اول، در محیط کشت باکتری فعالیت مخصوص U/mg 394 را داشت و در نهایت، پس از انجام مراحل خالص سازی فعالیت مخصوصش به U/mg 13666 رسید. روند خالص سازی توانست توکسین را 35 برابر خالص کرده و 47 % توکسین اولیه را تخلیص و بازیابی نماید. نتایج الکتروفورز روی ژل SDS-PAGE حاکی از خلوص حدودی آلفاتوکسین بود. نتایج ایمونودیفیوژن دوطرفه و شعاعی یکطرفه وجود آنتی بادی مربوطه را تایید نمود. در فرایند وسترن بلات، دو زنجیره سبک و سنگین ایمونوگلوبین توسط مرکاپتواتانول از هم جدا شده و در الکتروفورز فقط با پروتئین 48 کیلودالتونی بر روی غشاء نیتروسلولزی واکنش داد.

نتیجه گیری نهایی:

نتایج این تحقیق منجر به دستیابی به روش خالص سازی آلفاتوکسین کلستریدیوم سپتیکوم و آنتی بادی علیه آن سریعتر و اقتصادی تر از روش های سایر محققین گردید.