اولین گزارش از وقوع سوختگی جوانه و سرشاخه درختان گلابی با عامل Phoma glomerata در ایران

طی بازدید های انجام شده طی نیمه پایانی زمستان 1397 تا ابتدای بهار 1398 از باغات گلابی در استان مازندران، نشانه هایی مشابه سوختگی در سرشاخه ها و جوانه های جانبی مشاهده شد. به منظور بررسی و شناسایی عامل بیماری، نمونه های دارای علایم به آزمایشگاه منتقل گردید و پس از ضد عفونی سطحی توسط الکل اتانول 70% و محلول هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد در تشتک های پتری حاوی محیط کشت آب آگار (WA) و سیب زمینی دکستروز آگار (PDA) همراه با 5/1 درصد آنتی بیوتیک تتراسایکلین و استرپتومایسین کشت داده شد و در دمای 25 درجه سلسیوس نگهداری گردید. پرگنه قارچ، ابتدا به رنگ کرم تا قهوه ای روشن و سپس به رنگ سبز تیره تغییر رنگ یافت و پس از پنج روز پیکنیدیوم های قارچ در محیط کشت ظاهر شدند. در نهایت خالص سازی جدایه های قارچی به روش نوک ریسه و تک اسپور انجام و جدایه های خالص درتشتک های حاوی محیط کشت PDA کشت داده شد. پیکنید ها تیره رنگ و تقریبا صاف با گردن نسبتا بلند بوده و کنیدی های آن اغلب تک سلولی و تقریبا تخم مرغی شکل تا بیضوی و شفاف اما در توده اسپور تیره رنگ بودند. کلامیدوسپور های آن نامنظم و در زنجیره های منشعب و غیرمنشعب به صورت میانی و انتهایی تشکیل شدند. بر اساس خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی قارچ در محیط کشت و طبق توصیف ارایه شده توسط منابع معتبر علمی (Boerema et al., 2004)، گونه Phoma glomerata شناسایی شد. آزمون های بیماری زایی بر روی ده نهال سالم یک ساله و شاخه های فاقد بیماری انجام شد. سوسپانسیون حاوی اسپور های ثانوی با غلظت (106 × 1 اسپور در میکرو لیتر) روی آن ها پاشیده شد. گیاهان شاهد تنها با آب مقطر سترون آغشته شدند و پس از قرار دادن در محفظه پلاستیکی در دو دامنه دمایی 2 ±15 و 2± 23 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 90%، در گلخانه نگهداری شدند. پس از ده روز علایم بیماری شامل لکه های زرد با حاشیه سوخته مشاهده شد که با علایم ارایه شده در منابع (Chuan and Chand, 1980) مطابقت داشت. گیاهان شاهد فاقد علایم مزبور بودند. به منظور تهیه توده میسلیومی جهت استخراج DNA ژنومی، از محیط غذایی PDB (Potato dextrose broth) استفاده شد. استخراج DNA به روش CTAB انجام گردید (Doyle and Doyle, 1987؛ امیردهی و همکاران، 1396). نواحی ژنومی ITS1-5.8S-ITS2 تکثیر و تعیین توالی شدند. جهت تکثیر این نواحی از ترکیب آغازگر ITS1 با توالی)'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'5) به عنوان آغازگر مستقیم و آغازگر ITS4 به عنوان آغازگر معکوس با توالی ('-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'5) استفاده شد (White and Morgan, 1987؛ White et al., 1990). مخلوط واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرو لیتر شامل 5/6 میکرو لیتر آب دیونیزه استریل، 5/13 میکرو لیتر 2X PCR Master Mix ، 5/0 میکرو لیتر از هر آغازگر به غلظت نهایی 10 پیکومول و 4 میکرو لیتر DNA طی واکنش زنجیره ای پلی مراز شامل واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت دو دقیقه و سپس 38 چرخه تحت           1- دانشجوی دکتری، گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران 2- دانشیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی مازندران، ساری، ایران نویسنده مسیول مکاتبات: p_teymuri@yahoo.com شرایط واسرشت سازی در 94 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 50 درجه سلسیوس 30 ثانیه، گسترش در دمای 72 درجه سلسیوس 30 ثانیه و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفت و سپس محصول نهایی از طریق الکتروفورز در ژل آگارز 2/1 درصد ارزیابی شد (White et al., 1990). پس از تعیین توالی و همردیف سازی با توالی های موجود در بانک ژن GenBank (NCBI) توسط نرم افزار BLAST مقایسه و شباهت جدایه های مورد نظر با قارچ Phoma glomerata (Corda) Wollenw & Hochapfel در سطح 99 درصد مشخص گردید. قارچ Phoma glomerataاولین بار از کشور هند به عنوان عامل بیماری در فیکوس گزارش گردید Mathur, 1979)). همچنین این قارچ با علایم سرخشکیدگی و سوختگی جوانه های جانبی گلابی نیز برای اولین بار از هند گزارش شد (Chuan and Chand, 1980). در ایران نیز وجود این قارچ اولین بار بر روی گندم (صفایی و همکاران، 1379) گزارش گردید و پس از آن بر روی کدوییان (حاتمی و همکاران، 1387)، فیکوس (آقاپور و همکاران، 1388)، نارنگی (رستمی و همکاران، 1392)، رزماری (Moshrefi Zarandi et al., 2015) در مناطق مختلف ایران گزارش شد. بنابراین این قارچ تاکنون در ایران بر روی درختان گلابی گزارش نشده است و این اولین گزارش از وقوع سوختگی جوانه و سرشاخه با عامل قارچی Phoma glomerataروی درختان گلابی (Pyrus communis) در ایران است.