بیان دو سیسترونی و پایدار فاکتور 9 انعقادی انسانی و پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در سلول های تخمدان همستر چینی سازگار با کشت معلق

 درمان فعلی هموفیلی B درمان جایگزینی است که شامل تزریق داخل وریدی فاکتور 9 انسانی خالص شده از پلاسما یا فرم نوترکیب تولید شده در سلول های پستانداران است. در تحقیق حاضر با استفاده از یک سیستم بیانی دو سیسترونی، بیان پایدار فاکتور 9 انسانی در رده سلولی تخمدان همستر چینی سازگار با کشت معلق (CHO-s) و محیط عاری از سرم مورد بررسی قرار گرفت.

 یک قطعه DNA متشکل از توالی های نوکلیوتیدی فاکتور 9 انسانی، جایگاه میانی ورود ریبوزوم و پروتیین فلورسنت سبز تقویت شده در وکتور بیانی pcDNA3.1 تحت کنترل پروموتر سایتومگالو ویروس همسانه سازی شد. پلاسمید دوسیسترونی حاصل با استفاده از آنزیم برشگر BglII خطی و در سلول های CHO-s ترانسفکت شد. سلول های ترنسفکت شده به مدت 14 روز تحت تیمار با ماده جنتیسین قرار گرفتند. سپس محیط کشت سلول های پایدار جمع آوری و بیان فاکتور 9 با استفاده از وسترن بلاتینگ و الایزا بررسی شد. فعالیت انعقادی نیز با روش کروموژنیک مورد ارزیابی قرار گرفت.

سلول های CHO-s نوترکیب و مقاوم به جنتیسین، زیر میکروسکوپ فلورسنت به رنگ سبز مشاهده شدند که حاکی از بیان و تجمع پروتیین فلورسنت سبز تقویت شده در سیتوپلاسم سلول ها بود. نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ، بیان و ترشح فاکتور 9 نوترکیب به داخل محیط کشت را تایید کرد. مقدار فاکتور 9 ترشح شده ng/mL/106 150 و فعالیت انعقادی آن mU/mL 0/2 ± 5/6 محاسبه شد.

یافته های ما نشان داد که این سیستم بیانی دو سیسترونی توانایی تولید هم زمان پروتیین فلورسنت سبز تقویت شده و فاکتور 9 انسانی را در سلول های CHO-s دارد. این سامانه بیانی، فرایند انتخاب و جداسازی سلول های بیان کننده فاکتور 9 را تسهیل می کند