بررسی ژنومی وکلونینگ ژن فیبرینولیتیک (BsfA) باسیل ترموفیل خاک در باکتری اشریشیا کلی اوراگامی با روش مولکولی Real time PCR و تکنیک SDS

آنزیم ها نقش بسیار مهمی در صنایع مختلف و در پزشکی دارند. ناحیه ژنومی bsfA نیز یکی از اپران های بسیار مهم در زیست فناوری و زیست مهندسی به شمار می رود و در تهیه داروهای شکننده فیبرین (فیبرینولیتیک) یا داروهای شکننده لخته برای از بین بردن لخته خون در عروق (درمان ترومبوزیس و سکته قلبی) به کار می روند و می توان ازاین آنزیم در موارددرمانی استفاده کرد. باسیلوس ترموفیل حامل ژن های آنزیمی مختلفی بوده و هدف بررسی ژنومی و کلونینگ ژن فیبرینولیتیک (bsfA) از باسیل های ترموفیل خاک در باکتری اشریشیاکلی اوراگامی با روش Real time PCR  و  SDS PAGE است.

سویه باسیلوس از مجموع 70 نمونه خاک مناطق اطراف تهران جداسازی و تعیین هویت شدند. سپس با روش PCR  ژن bsfA از باسیلوس ها استخراج شد. قطعه تکثیر یافته توسط روش TA کلونینگ (Transfer activity) به داخل وکتور بیانی pTG19  وارد شد. در مرحله بعد وکتور نوترکیب به باکتری اشریشیا کلی اوراگامی ترانسفورم شد و با استفاده از روش های رایج تایید کلونینگ انجام گردید. واکنش PCR برای ژن  bsfA با پرایمر ذکر شده انجام شد.

در نتیجه از 12 سویه باسیلوس جدا شده همگی (100%) واجد ژن bsfA بودند. نتایج کلونینگ RNA کلنی های مشکوک استخراج شده cDNA ساخته شده و توسط آزمون Real time PCR میزان بیان ژن bsfA بررسی شدند. تعیین هویت مولکولی جنس باسیلوس حامل ژنbsfA  از پرایمرخانگی استفاده گردید. در نهایت با سکانس محصول PCR بیان ژن bsfA در باکتری اشریشیاکلی اوراگامی تایید شد.

در نتیجه این پژوهش موفق به یافتن باسیلوس های بومی مولد bsfA  شدند که در نهایت، با موفقیت ژن این آنزیم از باکتری باسیلوس به باکتری E.coli منتقل شد تا بتوان با تولید بیشتر و صرفه اقتصادی این آنزیم را در E.coli تولید کرد. برای ایجاد باکتری با قابلیت نوترکیب و بیان بالا، می تواند گام بزرگ در مسیر افزایش تولید این آنزیم در درمان بیماران دچار ترمبوزیس محسوب شده که مانع از ایجاد آمبولی و مرگ می گردد.