طراحی و ساخت وکتور بیانی pET32b+Rh براساس سیستم pET جهت تسهیل پروسه تخلیص پروتئین نوترکیب

خالص سازی پروتیین ها یک مرحله ضروری برای بررسی عملکرد و ساختار آنها است. به منظور تسهیل تخلیص، پروتیین ها غالبا به برچسب تمایلی متصل می شوند. هدف از این تحقیق طراحی و ساخت وکتور pET32b(+)Rh بر اساس وکتور بیانی پرکاربرد pET-32b(+) در جهت تخلیص آسان تر پروتیین های نوترکیب و تنها با استفاده از ستون تمایلی نیکل می باشد. بعد از طراحی پرایمر، با استفاده از واکنش PCR قطعه مورد نظر تکثیر یافت و در وکتور pET-32bهمسانه سازی شد. وکتور نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای ترانسفورم گشت. بعد از غربالگری با تست کلونی- PCR و آنالیز آنزیمی، تعیین توالی شد. مطالعه عملکرد وکتور با بررسی بیان و تخلیص یک پپتید کوچک سمی دارای پیوندهای دی سولفیدی در وکتور pET32b(+)Rh انجام شد. در وکتور جدید pET32b(+)Rh، محل برچسب هیستیدینی در ناحیه انتهای کربوکسیل تیوردوکسین حذف شده و همچنین ناحیه انتهای آمینی پپتید نوترکیب درصورت استفاده از آنزیم BamHI تغییر چندانی نخواهد کرد. برای بررسی عملکرد وکتور، بیان محلول یک پپتید سمی در آن با بررسی و تخلیص دومرحله ای با استفاده از روش IMAC، منجر به تخلیص پپتید نوترکیب شد. در این تحقیق از روش ساده و سریع کلونینگ برای دسترسی به یک وکتور تغییر یافته بیانی با استفاده از پلاسمید تجاری موجود، استفاده شد. از وکتور جدید pET32b(+)Rh می توان برای بیان پپتیدهایی با ساختار پیچیده که نیازمند به تغییر پس از ترجمه و فیوژن با تیوردوکسین هستند، بهره برد و سپس از تخلیص ساده تر بدون نیاز به ستون کروماتوگرافی دیگر یا روش های پر هزینه ای نظیر HPLC و FPLC برای تخلیص نهایی آن استفاده کرد.