خالص سازی آنزیم کیتیناز 42 از Trichoderma atroviride PTCC5220

قارچها یکی از عوامل مهم بیماریزا در گیاهان زراعی مختلف می باشند. یکی از راه های کنترل بیماری های قارچی، محدود کردن رشد قارچها در ریزوسفر گیاه می باشد. از موثرترین روش های مورد استفاده می توان از ژنهای کیتینازی در گیاه جهت تولید آنزیمهای کیتینازی نام برد. این آنزیمها، غالبا با فروپاشیدن اجزای ساختاری قارچها، به مبارزه با این عوامل بیماریزا می پردازند. در میان اجزای ساختاری قارچ، دیواره قارچی، نخستین و مهم ترین سدی است که در برابر اثر آنزیمهای هیدرولازی قرار می گیرد. از این رو، بسیاری از آنزیمهای هیدرولازی بویژه آنزیمهای کیتینازی، وظیفه اختصاصی از بین بردن اجزای تشکیل دهنده دیواره قارچی را بر عهده می گیرند.. باتوجه به اهمیت ویژه آنزیم کیتیناز 42 کیلو دالتونی در این فرآیند، و جهت بررسی تاثیر این آنزیم بر دیواره قارچهای بیماریزا، خالص سازی آن ضروری می باشد. در این تحقیق 31 جدایه مختلف قارچ تریکودرما از نظر تولید آنزیمهای کیتینازی در محیط کشت مایع CZ-DOX واجد کیتین با هم مقایسه شد. جدایهTrichoderma atroviride PTCC5220 با فعالیت ویژه آنزیمی U/mg 97/0 آنزیم کیتیناز بعنوان جدایه برتر انتخاب گردید. جهت خالص سازی آنزیم کیتیناز 42 کیلو دالتونی (Chit42)، از کروماتوگرافی تعویض یونی در بستر CM-Sepharose Fast Flow وDEAE- Sepharose Fast Flow استفاده گردید. نتایج مربوط به خالص سازی با استفاده از بستر CM-Sepharose نشان داد که آنزیم Chit42 همراه با سه پروتئین دیگر بصورت یک قله با فعالیت آنزیمی در ناحیه غلظت نمکی 5/0 تا 6/0 مولار و در ستون DEAE- Sepharose این آنزیم در ناحیه غلظت نمکی 25/0 تا 35/0 مولار خالص می گردد. نتایج حاصل از SDS-PAGE قله بدست آمده از ستون DEAE، وجود یک باند با وزن ملکولی حدود 42 کیلو دالتون را نشان می دهد. بازده خالص سازی با استفاده از کرماتوگرافی تعویض یونی CM-Sepharose و DEAE بترتیب 2/41 و 8/61 برابر حالت غیر خالص (در محیط کشت مایع) می باشد.