اندازه گیری همزمان 25- هیدوکسی کوله کلسیفرول و 25- هیدورکی ارگوکلسیفرول به روش کروماتوگرافی مایع به کارایی بالا

با توجه به شیوع بالای درجات مختلف کمبود ویتامین D در ایران، ارزیابی صحیح وضعیت این ویتامین برای مقاصد بالینی، پژوهشی و بهداشتی اهمیت به سزایی دارد. غلظت سرمی 25-هیدروکسی D) D(OH) (25، به عنوان نماگر معتبر وضعیت ویتامین D پذیرفته شده است. سنجشهای مبتنی بر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، روش های استاندارد اندازه گیری 25(OH)D به شمار می آیند. هدف از انجام این مطالعه راه اندازی یک روش معتبر و نسبتا ساده مبتنی بر HPLC برای اندازه گیری غلظت سرمی 25(OH)D با به کار گیری آشکارساز فرابنفش بود.
پروتئینهای سرم با استفاده از اتانل و سپس آمیز? متانل: ایزوپروپانل (90:10، حجمی) رسوب داده و سپس 25-هیدروکسی کلسیفرول به کمک فاز آلی هگزان، استخراج شد. هگزان تحت گاز ازت تبخیر و رسوب حاصله در متانل حل شد و پس از فیلتراسیون،نهایتا μL 20 از محلول صاف شده به ستون Teknochroma tracer excel 150 4، 3μm تزریق و کروماتوگرافی با فاز متحرک متانل: آب (85:15، حجمی) حاوی 01/0 درصد BHT و دمای ستون °C 40 انجام شد. این روش قادر به شناسایی افتراقی D3(OH)25 و D2(OH)25 در طول موج nm 265 بود. نتایج حاصل از آزمایش 90 نمون? سرم انسانی با این روش، با نتایج دو روش رایج پرتو-ایمنی سنجی (RIA) و واکنش رقابتی پیوند به پروتئین (CPBA) مقایسه گردید. درج? همخوانی نتایج این سه روش با استفاده از تعیین ضریب همبستگی و آنالیز بلند-آلتمن ارزیابی شد.
زمان بازداری برای D3(OH)25 و D2(OH)25 به ترتیب 5/9 و 7/10 دقیقه به دست آمد. منحنی های استاندارد برای D3 (OH) 25 تا غلظت nmol/L 375 و برای D2(OH) 25 تا غلظت nmol/L 5/187 خطی بود. حد آشکار سازی برای هر دو ویتامر L/nmol 5/12 بود. درصد بازیافت برای D3(OH)25 و D2(OH)25 در آزمایش های متعدد به ترتیب 6/5 ± 101% و 4/5 ± 8/100% به دست آمد. تغییرات درون و میان سنجشی برای D3(OH)25 به ترتیب 1/8% و 6/12% بود. دو روش RIA و CPBA نتایج بالاتری نسبت به HPLC به دست دادند (02/0=p). روش RIA در مقایسه با CPBA همخوانی بیشتری را با HPLC نشان داد.
نتیجه نهایی: روش HPLC معرفی شده در این مطالعه برای اندازه گیری سطوح سرمی 25(OH)D، روشی است قابل اعتماد و نسبتا سریع با این مزیت که توانایی شناسایی افتراقی 25(OH)D2 و 25(OH)D3 را نیز دارد.