کلونینگ و شناسایی ژنGRA4 توکسوپلاسما گونده ای سویه RH در پلاسمید یوکاریوت بیانی pcDNA3

توکسوپلاسموزیس به وسیله یک انگل تک یاخته داخل سلولی (توکسوپلاسما گونده ای) ایجاد می شود و در سراسر جهان گسترش دارد. این بیماری دارای اهمیت عمده پزشکی و دامپزشکی است و عامل بیماری مادرزادی در انسان و حیوانات اهلی است. علاوه بر این، به تازگی به دلیل آنسفالیت در افراد ایدزی به اهمیت آن افزوده شده است. به همین دلیل تهیه یک واکسن مؤثر علیه توکسوپلاسما یک هدف مهم در جهان است. آنتی ژن گرانولی 4 (GRA4) به عنوان یک آنتی ژن عمده توکسوپلاسما گونده ای شناخته شده است. از این رو، به عنوان یک کاندیدا برای تهیه واکسن ملاحظه شده است. آنتی ژن گرانولی 4 از برادی زوئیت ها و تاکی زوئیت ها ترشح می شود. این ژن به صورت کپی تک و فاقد اینترون است. هدف از این تحقیق، تهیه پلاسمید نوترکیب حاوی ژن GRA4 است که بتوان از آن به عنوان DNA واکسن استفاده کرد.
در این تحقیق ژن GRA4 پس از تکثیر به روش PCR در پلاسمید pTZ57R کلون شد. سپس در باکتری اشرشیاکلی سوش TG1 ترانسفورم شد. پلاسمید نوترکیب پس از تکثیر از باکتری میزبان استخراج و ژن هدف با استفاده از برش آنزیمی، با آنزیم های KpnI و EcoRI از پلاسمید pTZ57Rجدا شد. از طرف دیگر پلاسمید pcDNA3 برای پذیرش قطعه GRA4 و انجام کلونینگ نیز با آنزیم های KpnI و EcoRI برش داده شد. GRA4 درون پلاسمید pcDNA3 ساب کلون شد و این محصول واکنش اتصال در باکتری های فوق ترانسفورم شده و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند؛ پلاسمیدهای نوترکیب pcGRA4 به وسیله کیت استخراج پلاسمید، از اشرشیاکلی تخلیص شدند.
صحت کار با روش های PCR و برش آنزیمی به کمک آنزیم های اختصاصی فوق با استفاده از الکتروفورز تایید شده و نتایج نشان داد، قطعه GRA4 در پلاسمید pcDNA3 کلون شده است و باند حدود 1058 جفت بازروی ژل آگاروز ایجاد شده بود که هم اندازه ژن GRA4 توکسوپلاسما گونده ای است و تایید نهایی با استفاده از توالی یابی انجام شد.
نتایج حاصل نشان داد، کلونینگ و ترانسفورم قطعه GRA4 در پلاسمید pcDNA3 با موفقیت انجام شده است.