تولید آنتی بادی اختصاصی پروتئین PGIP1 بیان شده به صورت هترولوگ در باکتری با استفاده از آن جهت تایید بیان PG در گیاهان کلزای تراریخت

قارچهای بیماریزای کلزا که سالانه خسارت زیادی را به این محصول وارد می کنند برای نفوذ در گیاه، با ترشح آنزیمهایی باعث تجزیه مولکولهای دیواره سلولی آنها می شوند. در طی تکامل در گیاهان، پروتئینهایی برای مهار این آنزیمها بوجود آمده است. PGIP1 از جمله این پروتئینها بوده که قدرت نفوذ قارچ در گیاه را مهار می نماید. در این تحقیق با توجه به اینکه آنتی بادی علیه پروتئین PGIP1 لوبیا به صورت تجاری موجود نمی باشد و از طرفی جهت تایید بیان PGIP1 در گیاهان کلزای تراریخت بدست آمده نیاز به آنتی بادی مربوطه می باشد، لذا اقدام به تولید پروتئین PGIP1 در سیستم پروکاریوتی و استفاده از آن جهت تولید آنتی بادی علیه آن گردید. بدین منظور ژن کد کننده PGIP1 کلون شده در pUC19 بوسیله آغازگرهای اختصاصی RB وRB2H (به ترتیب حاوی سایتهای Nde1 وXho1) تکثیر و پس از هضم با این دو آنزیم در ناقل pET26b(+) کلون گردید. پلاسمید حاصله پس از تاییدهای مولکولی به میزبان بیانی E. coli BL21 (DE3)pLysS منتقل گردید. جهت بهینه سازی شرایط بیان ژن مورد نظر، شرایط مختلفی شامل، غلظتهای متفاوتIPTG، دماهای متفاوت کشت و OD زمان القا در کلونی های متفاوت مورد بررسی قرار گرفت و نهایتا OD=0.3، دمای 37 درجه سانتی گراد و IPTG =0.5mM بعنوان بهترین شرایط بیانی معرفی گردید. از آنجا که توالی هیستیدین در انتهای پروتئین کد شده وجود دارد، جهت تایید بیان پروتئین PGIP1 توسط آزمون وسترن بلات از آنتی بادی Anti-His استفاده گردید. پروتئین خالص شده در شش نوبت به دو خرگوش تزریق شد. جهت بررسی میزان تیتر آنتی بادی از آزمون الایزا استفاده گردید. از آنتی بادی تولید شده جهت تایید بیان پروتئین PGIP1 تولید شده در گیاهان کلزای تراریخت استفاده گردید. نتایج حاصل از آزمون وسترن بلات وجود پروتئین مورد نظر را در پروتئینهای استخراج شده از برگ گیاهان کلزای تراریخت در مقایسه با کلزای غیر تراریخت تایید نمود.