کلونینگ و توالی یابی بخشی از ژن فسفولیپاز B1 در آسپرژیلوس فومیگاتوس

قارچ کپکی آسپرژیلوس فومیگاتوس به عنوان میکروارگانیسمی پاتوژن، آلرژن، آلوده کننده مواد غذایی، مولد میکوتوکسین و عامل میکوتوکسیکوز مورد توجه بوده و نظر به ازدیاد فزاینده موارد عفونت ناشی از این میکروارگانیسم و بروز مقاومت دارویی، اهمیت بالینی آن رو به افزایش گذاشته است. قدرت تولید انواع فسفولیپازها، به ویژه فسفولیپاز B1، از عوامل موثر در ویرولانس این قارچ به شمار می رود. به این جهت، کلونینگ و توالی یابی ژن فسفولیپاز B1 برای بررسی و تجزیه و تحلیل ویژگی های ژن سنتز کننده آن در میکروارگانیسم مذکور و مقایسه خصوصیات ژن و فرآورده آن با ژن فسفولیپاز سایر میکروارگانیسم ها انجام شد.
DNA ژنومی آسپرژیلوس فومیگاتوس موجود در خلط یک بیمار مبتلا به آسپرژیلوس ریوی استخراج و تلخیص شد و با استفاده از PCR دژنراتیو قطعه اولیه از ژن plb1 به طول 545 bp به دست آمد. برای جداسازی قطعه طویل تری از این ژن،DNA ژنومی با تعدادی منتخب از اندونوکلئازهای با اثر برشی محدود هضم شد و قطعات حاصل ازهضم با استفاده از DNA لیگاز T4به صورت حلقوی در آمد و سپس از طریق PCR معکوس قطعه طویل تری به طول 1800bp به دست آمد. توالی نوکلئوتیدی قطعه ژن حاصل متعاقب استخراج از ژل، خالص سازی، پیوند به وکتور مناسب، ترانسفورماسیون، استخراج از سلول میزبان و نهایتا تلخیص تعیین شد. با تلفیق این توالی با توالی قطعه اولیه، در نهایت، توالی ای به طول 2197bp حاصل گردید.
تجزیه و تحلیل فرآورده PCR دژنراتیو اولیه و همچنین قطعه حاصل از PCR معکوس با بلاست X درسطح اسیدنوکلئیک حداکثر76% همسانی با توالی ژنتیکی لیزوفسفولیپاز آسپرژیلوس اوریزه و حداقل 45% همسانی با توالی ژنتیکی فسفولیپاز B کریپتوکوکوس نئوفورمنس را نشان داد.
وجود ژن فسفولیپاز B1 در ژنوم میکروارگانیسم و همسانی بسیار بالای قطعه توالی شده با ژن فسفولیپاز سایر میکروارگانیسم های با یا بدون قرابت فیلوژنیک با این قارچ نزدیک نشان دهنده انتقال محافظه کارانه آن در مسیر تکاملی از ژنوم دودمانی و همچنین نقش اساسی آن در ویرولانس میکروارگانیسم است. توالی نوکلئوتیدی حاصل می تواند برای مشابه سازی ژن کامل plb1، تعیین توالی ژن کامل و تعیین و تجزیه و تحلیل خصوصیات پروتئین (آنزیم) حاصل از ژن، و نهایتا، طراحی و سنتز واکسن یا داروی موثر علیه میکروارگانیسم مورد استفاده قرار گیرد.
ر